徠卡激光共聚焦顯微鏡能夠獲得比普通光學顯微鏡更高的分辨率,可以清晰地觀察到細胞內精細的結構和微小的病變。例如在神經科學研究中,可以更清楚地看到神經元的細微結構和突觸的形態。通過對樣品進行逐層掃描,可以獲得一系列不同深度的光學切片,重建出樣品的三維結構。這對于研究生物組織的立體結構、細胞間的空間關系等具有重要意義,比如在胚胎發育研究中觀察器官形成的三維過程。
能夠檢測到非常微弱的熒光信號,對于低表達水平的熒光標記樣本也能有很好的成像效果,有助于發現一些難以察覺的生物分子和細胞活動。可以在不破壞細胞活性的情況下,對活細胞進行長時間的動態觀察,實時記錄細胞內的各種生理過程,如細胞分裂、物質運輸等,為研究細胞的生命活動提供了有力工具。可以同時對多個熒光標記的樣本進行成像,方便研究不同物質或結構在同一細胞或組織中的分布和相互關系,例如在免疫熒光實驗中同時觀察多種抗原的表達情況。
徠卡激光共聚焦顯微鏡的基本工作原理:
-點光源照射:以激光作為光源,激光束通過照明針孔,形成直徑小的點光源。這個點光源經過透鏡系統后,準確地聚焦在樣品焦平面上的某一個微小點上。由于激光具有高度的方向性和相干性,能夠提供高強度、高穩定性的照明,為后續的成像奠定了基礎。
-逐點掃描:在點光源聚焦于樣品焦平面上的某一點后,開始進行逐點掃描。通過精密的掃描裝置,控制激光束在樣品焦平面上按照一定的規律進行移動,依次對焦平面上的各個點進行照射。每一次照射都只激發樣品焦平面上一個小區域內的熒光物質,使其發出熒光。
-點探測成像:被激光激發的熒光會向各個方向傳播,其中一部分熒光會沿著原路返回,通過透鏡系統再次到達探測針孔。由于只有焦平面上的點發出的熒光能夠準確地通過探測針孔,而焦平面以外的雜散光則會被探測針孔阻擋在外,因此大大提高了成像的對比度和清晰度。穿過探測針孔的熒光被光電倍增管等高性能探測器接收,并將其轉換為電信號。這些電信號經過放大、處理后,被傳送到計算機中進行進一步的分析和處理,形成清晰的共聚焦圖像。